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李时珍新补入药物374种。该书图文并茂，有药物图1109幅。作者为了增加该书的临床参考价值，于若干药的论述中附录临床处方11096首，其中8000多首来自作者临床经验之总结或多年之征集，有着较好的参考价值。
《本草纲目》共分水、火、土、金石、草、谷、菜、果、木、服器、虫、鳞、介、禽、兽、人等16部为纲，62类为目，其分部类的原则为“从微至巨，从贱至贵”。搜罗群集，有谓其所参考之书多达800余种者，可谓“贯串百氏”的一代巨著。该书又在每药物之下，标正名为纲，附释名为目，故命名其书为《本草纲目》。每药之论述内容，则详之于集解、辨疑、正误、修治（炮制加工）、气味（药性药理）、主治（药效）、发明（李时珍之心得体会和研究结论）、附方等。《本草纲目》之分类叙述方法是在前人基础上的一次创造性发展，条分缕析，使读者一目了然，其分类方法实际上已具备了现代生物进化思想的科学性。
《本草纲目》的分类是先无机而后有机，先植物后动物。
在植物类药物中，则先草、谷、菜而后果、木；在动物类药物中，则先虫、鳞、介而后禽、兽，最后则叙述人类药。
该书首先是对矿物药之科学分类，这在无机化学方面也已具备一定的水平。书中所记载的19种单体元素，如：钠、钾、钙、镁、金、银、铜、锌、锡、汞、铝、锰、铅、铁、砷、硫等等，如以化合物计则多至数十种。李氏所述之每一物质，均评论其来源、鉴别与化学性。该书以单体元素为纲，对各化合物作了比较全面的论述和分类，大体上对前代所存在的混乱作了澄清。在生物药的分类方面，可以说是划时代的，基本上采用了“双名法”。其法虽不能与现代所应用的拉丁系统双名法那么科学精确相比，但在明代却是世界上最为先进的。
其次在关于动物药之分类方面，基本上有以下之特点，例如其虫类相当于无脊椎动物，鳞类相当于鱼类和部分爬行类，介类则相当于两栖类和少数软体动物类，其禽类则为鸟类，兽类系哺乳类动物。这种分类方法之依据虽然强调“从贱至贵”，但并非经济或社会地位价值观念上的贵贱，实则包含着从单细胞生物到多细胞生物，从单一到繁杂，从低等生物到高等生物的发展过程。就贱贵而言，作者将封建社会至高无上的龙与凤，均列入相应的低一级类别，并不因为皇帝为真龙天子，也不因为凤为皇后，就提高龙凤在该书类别中的地位。这就说明《本草纲目》“从贱至贵”的分类方法并非地位、经济等之价值观。其分类方法富有科学性，代表了当时的先进水平，近代中外学者称赞其有着生物进化论思想，为把人为分类法推向自然分类法作出了重要贡献。
《本草纲目》在药物学发展方面，也作出了卓越的贡献。
不但订定了前人1518种药物，并以自己的亲身实践，调查研究，搜询访验，为中国医药宝库增加新药374种，这对一位学者来讲是一个十分巨大的数字。这里仅举若干例证说明之。
在药物鉴别方面，《本草纲目》纠正了明代之前《本草》中的许多错误和非科学内容。过去之本草著作往往将一物误认为二，如南星与虎掌，本来是一种药物，过去却误认为两种药物；又如本应当分述的却混而为一，《本草纲目》以前每将葳蕤、女萎并为一条，李氏经过鉴别则确认为两种；又如宋寇宗姡А侗静菅芤濉分写砦蟮亍耙岳蓟ㄎ疾荩戆匚俸稀保账獭锻季静荨方旎ā⒗シ治酱ν夹危导噬媳臼且恢种参锏母橛牍担磺叭舜砦笕衔安葑涌梢员溆恪保奥砭氲乇湮簟钡鹊却担捕家灰痪侗静莞倌俊范枰跃勒⒅赋鲇隳擞阕铀舯臼侵参铩�
关于水银的记述，更能说明李时珍严肃认真求实的科学态度和无畏精神。《神农本草经》被封建社会尊为经典，其叙述水银“久服神仙”，晋葛洪《抱朴子》谓为“长生之药”，《大明本草》称其“无毒”，唐甄权言其“还丹元母”。故在六朝之下，企图贪生不死者因服之而成废身甚而夭者不知有多少。《本草纲目》批判了这一非科学的讹传，指出“水银……
入骨钻筋，绝阳蚀脑，阴毒之物，无似之者。“他严肃地强调：”方书固不足道，本草岂可妄言哉。“历史和科学实验均证实了《本草纲目》所论述的水银，在当时达到科学发展的最新水平，对彻底根除服水银以求长生之荒谬做法产生了积极的作用。
关于生物对生活环境的适应，《本草纲目》也有独到见解。
以动物药的描述为例，《纲目》对每一动物药的动物都有概括性的定义，多能抓住各类动物的生物学属性特征。如指出“鸟产于林，故羽似叶；兽产于山，故毛似草”，又说：“毛合四时，色合五方”，这都正确地掌握了禽兽对环境之适应以求保护的变异特点。在动物相关变异方面，该书正确指出：“乌骨鸡但验舌黑”即可知其骨黑的鉴别方法。《本草纲目》在有关药物的论述上，还强调了生物受到人工方法的干预而在生活习性方面产生改变的特性。如记述的动物变野生为人工驯养，家种植物可以优于野生等，说明当时对生物之遗传特征已有一些知识。
在制药化学和实验研究方面，《本草纲目》较以前也有着突出的成就。所载制药化学包括有蒸馏、蒸发、升华、重结晶、风化、沉淀、干燥、烧灼、倾泻等许多化学反应的方法。
所制取的醋酸铅（铅霜）；利用消石与矾石分解和氧化作用制取铅丹；以浓茶煎熬五倍子，使其产生沉淀；经曲菌发酵水解而析出没食子酸的白色结晶，都达到了较高的科学水平，甚至是最早的记录。在科学实验方面，作者不但亲自验证了罗勒子治疗眼翳和自服蔓陀罗花以观察其治疗效果和麻醉作用外，还对若干药物的药理作用等进行了动物实验。他观察大豆、鸡肠草等之药理作用，他解剖鲮鲤、蛇等多种低等动物，以证实其解剖结构上的异同，进行了若干比较研究。这些方法在当时科学界也可以称得上是一个创举。
当然，未知或知之甚少在当时更是普遍的，在当时条件下不可知者也非少见。因此，作者对若干药物的记述客观地指出“未审然否”，或谓：“亦无所询证，姑附于此，以俟博识”，足可证明其实事求是的科学态度。
《本草纲目》问世后其影响面之广而深远是创记录的。明万历十八年（1590年）由金陵（今南京）胡承龙首次刊刻，世称“金陵本”，至今尚存有极少几部，除日、美、德均有收藏外，我国仅存两部。1603年由夏良心等刊行于江西刻本《本草纲目》，世称“江西本”，为仅次于金陵本之善本，现存于世者尚多。此后，重刻《本草纲目》者逐渐增多，如湖北本（1606年）、石渠阁本、立达堂本等，均刻于明末之前。清代刻本以张朝璘本（1657年）、太和堂本（1655）等为最早，其后刻刊者甚多。据现存国内之刻印本统计，截止1949年约有70余版次。继《本草纲目》之后，我国药物学之发展在此基础上虽不如其广博，然在发挥、深化认识上和吸收外来药物上取得了不断的进步，如赵学敏撰《本草纲目拾遗》（1765年）等，几乎都是在其直接或间接影响下完成的。
《本草纲目》不但在国内有着如此深广的影响，早在公元1606年即传至日本。据统计，日本在1637…1714年间先后出现了《本草纲目》的8种刻本，此后还先后出版了日文节译和全译本多种。日本学者研究《本草纲目》并有著作者多达30余种。《本草纲目》在朝鲜、越南等也有较大的影响。大约从18世纪开始，《本草纲目》即传至欧洲，英国大英博物馆、剑桥大学图书馆、牛津大学图书馆、法国国民图书馆等都收藏有《本草纲目》的多种明刻本或清刻本。德国皇家图书馆收藏有金陵本。此外，在俄国（前苏联）、意大利、丹麦等也都有收藏。美国国会图书馆也收藏有金陵本和江西本等。据英国李约瑟博士考证，1732年法国医生范德蒙德曾将《本草纲目》中部分内容译为法文，几经周折于百余年后在巴黎发表，引起著名化学家和化学史学者的注目。据研究，《本草纲目》早在18世纪及以后的年代曾被部分摘译成法文、英文、德文和俄文，欧洲在19世纪对研究《本草纲目》与中国本学产生兴趣，并由此而获得